4月15日，FDA发布指南草案《利用下一代测序技术对人类基因治疗产品中的基因组编辑进行安全性评估》。这是主流药监首份针对基因编辑产品下一代测序（Next-Generation Sequencing，NGS）安全性评估的监管框架，为申办者提供了标准化的脱靶编辑和基因组完整性评估方法。该指南草案征求意见截至7月15日。

此前，FDA药品审评与研究中心（CDER）代理主任Tracy Beth Høeg在罕见疾病研讨会上透露，FDA近期将发布两份基因治疗指南草案并举办研讨会，进一步阐明并推进"合理机制"开发框架。第一份即本指南草案，第二份关于利用先验知识开发基因组编辑产品的指南预计很快发布。

目前，同类主题的EMA《基因治疗药物质量、临床前和临床方面》（2018年7月定稿）和我国《基因治疗产品非临床研究与评价技术指导原则（试行）》（2021年12月定稿）尚未阐述NGS用于非临床研究的安全性评价。

适用范围从DNA编辑到表观遗传和RNA编辑

指南草案补充了2024年1月定稿的《整合人类基因组编辑的人类基因治疗产品行业指南》，后者涵盖基因编辑全生命周期考量。

指南草案适用于开发涉及基因组编辑技术的人类基因治疗药品产品的申办者。2024年指南将人类基因编辑描述为在人类体细胞基因组特定位置添加、删除、改变或替换DNA序列的过程。然而基因编辑领域研究进展迅速，能够修饰表观遗传组或切割RNA序列的编辑技术已经出现。指南草案明确NGS评估也适用于编辑表观遗传组或转录组的产品，涵盖DNA编辑器、表观遗传编辑器和切割RNA的编辑器等多种基因编辑模式。

IND前应完成，超罕见病灵活处理，重大变更需额外分析

指南适用于所有非临床脱靶编辑和染色体易位研究，并建议申办者在原始IND申请提交前完成。详细研究报告应与原始IND申请一起提交。脱靶编辑和染色体易位研究结果也应以推荐格式一并提交。

可以灵活处理的情形是超罕见病适应症或单患者疗法，此时可能没有必要在原始IND阶段就开展评估脱靶编辑活性的研究。FDA鼓励申办者在IND申请提交前与FDA讨论研究计划。

指南强调全生命周期管理：如果在产品开发过程中发生制造工艺的重大变更，影响编辑器活性和/或靶向位点的编辑率，可能影响药品产品的脱靶编辑位点谱，或者识别出安全问题，则可能需要额外的脱靶编辑分析。在临床研究期间或在BLA提交中，申办者可能需要提交原始测序数据和用于分析测序数据的相关软件脚本。

NGS技术路线：从短读到长读，从靶向到全基因组

指南草案指出，申办者应使用适当测序策略。对于评估导致短段DNA变化（如≤50-bp）的靶向和非靶向位点的编辑，利用基于短读测序的方法的测序策略可能足够；然而为了评估更长段序列中是否存在大范围插入或缺失，可能需要基于长读测序。

测序应使用足量的输入材料进行，可能包括基因组DNA、细胞数或RNA。测序深度应允许检测潜在脱靶编辑事件，因为这些事件的频率或编辑率通常低于靶向编辑率。申办者应提供内部生成的数据（如代表性NGS运行数据）和来自同行评审出版物的相关信息，以支持测序深度和灵敏度，并支持其检测低频脱靶编辑事件的策略。在适用的情况下，FDA建议采用最小化PCR扩增偏差和/或引物偏差的策略。

指南对NGS和数据分析的提出明确的申报要求，包括：

• 细胞类型的详细描述、使用的细胞数、提取的核酸材料量、核酸提取过程、文库制备、引物信息和测序方法；

• 用于序列质量/深度评估、序列比对和任何额外序列分析步骤的生物信息学工具，以及命令行界面信息；

• 分析中使用的参考序列和数据库；

• 序列分析的每个步骤的简要描述，包括处理测序数据时在每个步骤应用的接受标准信息。

NGS数据分析结果和相关元数据应以表格格式提交，形式可以是文本、CSV或Microsoft Excel。

靶向和脱靶编辑位点评估：in silico提名方法

指南草案提供了用于脱靶编辑位点提名、脱靶编辑位点确认和脱靶分析参数的方法的建议。为了促进测定方法的可重复性和灵敏度，FDA建议，在缺乏既定的经验方法（生化或基于细胞的测定）来评估特定基因编辑模式安全性的情况下，申办者可以考虑采用其他广泛适用的方法来提名脱靶编辑位点。

FDA特别提出in silico脱靶编辑位点提名方法：对于基于CRISPR-Cas的产品，基于同源性的脱靶编辑位点搜索应包括DNA和gRNA中的错配和凸起（bulge），此外在实施基于同源性的脱靶编辑位点搜索时应考虑PAM要求或其他模式特异性序列要求；对于其他编辑模式，可以使用类似的in silico序列同源性搜索方法来考虑序列变异以进行脱靶编辑位点提名。

指南内容丰富，涵盖多个核心议题。上文仅为一小部分的概要，建议有需要的读者细读指南原文。