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哈佛大学维斯生物启发工程研究所

为了实现世界卫生组织的全球疟疾控制规划确定的根除疟疾的目标，在确定的地理区域消除疟疾寄生虫的所有本地传播是至关重要的。这条道路上的一个重要基石是发展迅速、敏感和特定品种的诊断能力，这在许多疟疾流行地区的低资源环境中非常有用。

目前，通过显微镜分析确定了引起疟疾的四种主要疟原虫：恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫和疟疾疟原虫，这些血样可以在红细胞中检测到疟原虫，或者通过所谓的针对特定疟原虫蛋白（抗原）的快速诊断测试来确定。

“不幸的是，现有的快速诊断方法不能区分所有的四种疟原虫，这对于开始最终的治疗过程是很重要的，而且，最重要的是，它们对于检测无症状个体中疟原虫的低数量是无效的。”医学博士Nira Pollock说，他是波士顿儿童医院传染病诊断实验室副医学主任、哈佛医学院病理学和医学副教授。“这些‘无症状携带者’是传播疟疾的蚊子无声的宿主，对全球根除疟疾的持续努力至关重要。”哈佛医学院儿科副教授、波士顿儿童医院传染病高级副医师、医学博士Jeffrey Dvorin补充说。

现在，一个由哈佛大学维斯生物启发工程研究所及MIT博士、维斯核心学院成员James Collins领导，由临床研究员、医学博士、公共卫生硕士Rose Lee还有Pollock 和Dvorin共同进行的多学科合作研究创建了一个领域适用的，超灵敏的诊断分析，专门检测所有疟原虫的DNA序列的症状和无症状疟疾。新的疟疾诊断方法结合了优化的10分钟快速样品制备方案和基于CRISPR的SHERLOCK系统，只需60分钟即可在简单的报告仪设备中实现高度特异性和灵敏的疟原虫检测。这篇研究发表在PNAS上。

“这一领域适用的SHERLOCK诊断疟疾分析超过了世界卫生组织对所需测试的敏感性和特异性要求，该测试可用于检测所有主要疟原虫物种的低寄生虫密度的无症状携带者，”维斯核心学院成员James Collins博士说：“它高度精简的设计可以为目前消除疟疾的诊断瓶颈提供可行的解决方案，并在资源匮乏的情况下更广泛地开展疟疾监测。”Collins是研究所活细胞设备重点领域的负责人，也是麻省理工学院医学工程与科学的泰米尔医学教授。

研究小组展示了他们的“SHERLOCK”（特异性高敏感性酶报告基因解锁法的缩写）试验能够检测出每微升血液中少于两种寄生虫，世界卫生组织建议的“检测极限”（LOD）在疟疾流行地区广泛使用。通过分析含有恶性疟原虫和间日疟原虫种类的临床样本，他们能够以100%的灵敏度、100%的特异性识别出真正的阳性样本，并在真正的阴性样本中正确识别出缺少某种疟原虫种类的样本，从而显示出该方法的临床潜力。接近100%的敏感性和特异性是用于真实世界测试的诊断分析的关键属性。此外，该分析还可以确定频繁突变的恶性疟原虫菌株的存在，这些菌株失去了HRP2抗原，从而逃脱了普通快速诊断测试的检测。

Collins在维斯研究所和麻省理工学院的团队与Feng Zhang在布罗德研究所的团队共同开发了SHERLOCK技术。它被授权给了初创公司Sherlock Biosciences，后者利用它为其他疾病的应用开发了一种快速分子诊断。最近，该公司的新冠快速诊断获得了美国食品药品监督管理局（FDA）的紧急使用授权。

其他的方法已经被开发出来，比如新的SHERLOCK实验，扩增和检测疟原虫的DNA（或RNA）核酸材料。但是，迄今为止，这些方法仍然受到对昂贵的实验室设备的需求的限制。例如，基于聚合酶链反应（PCR）的方法，复杂的样品制备技术以及受训过的专业人员，或者如在单一温度下执行更简单的“等温”扩增方法的情况一样，它们没有在现场显示出所需的灵敏度。

SHERLOCK疟疾试验利用了CRISPR-Cas12a酶，这种酶可以通过所谓的导向RNA激活，导向RNA与特定的目标核酸靶序列结合，在这种情况下，靶序列来自四种疟原虫中的一种。活化的Cas12a然后非特异性地裂解其附近的任何单链DNA链，其极高的翻转率约为每秒1250次侧切反应。研究人员在他们的实验中利用了这种放大活性，将其与优化的样品制备结合起来，不像其他核酸扩增测试（NAATs）那样需要特定的核酸提取步骤，也不需要在前端对疟原虫的特定DNA和RNA序列进行等温扩增。导向识别扩增的疟原虫序列中的物种特异性基序，然后释放Cas12a活性，它间接攻击单链DNA报告序列，这些报告序列的裂解产物有助于信号病原体特异性核酸的存在。在检测的后端，信号被设计成在手持设备中引起荧光变化，或在临床点护理设备中常用的横向流动条带上引起特定条带。

“重要的是，该试验与不同的样品类型兼容，如全血、血浆、血清和干血以及扩增所需的所有成分，Cas12a激活和信号产生所需的所有成分都可以在单个试管中冻干，重组并与患者样品混合后，以单锅反应的方式协同工作，”第一作者Rose Lee说，他是Collins团队和波士顿儿童医院的临床研究员，对传染病诊断有浓厚的兴趣，并与Collins一起组建了多学科团队：“这就避免了对功能性冷链的依赖，并且允许在低资源的环境下以最少的专业知识进行测试。。”

“该合作项目的疟疾诊断分子分析指出，维斯研究所在合成生物学领域的能力，再加上传染病生物学和流行病学方面的专业知识，可能会改变使全球大量人口瘫痪的真正使人衰弱的疾病的进程。”维斯研究所的创始董事Don Ingber说。他是医学博士，哈佛医学院和波士顿儿童医院的Judah Folkman血管生物学教授，也是哈佛大学John A. Paulson工程和应用科学学院的生物工程教授。