制药行业逐渐聚焦于开发下一代药品，包括靶向传递多重功效的活性成分，可以提高疗效和安全性。本文作者，Lonza龙沙细胞和分子生物学家Sweeney博士认为，双特异性抗体和多特异性抗体就是重要的新药研发方向之一，这类药物具有全新作用机制，疗效更优，同时还可以降低药物开发成本，缩短药物开发周期。 

市场增长，带动研发热情高涨

目前，市场上有两款获美国FDA批准的双特异性抗体（BsAb）产品：Fresenius Biotech和Trion Pharma联合开发的Removab（卡妥索单抗），用于治疗恶性腹水，以及安进开发的Blincyto（倍林妥莫双抗），用于治疗复发/难治性急性淋巴细胞白血病的。如今，全球有超过85个双特异性抗体处于临床开发阶段，而且这个数字还在不断增长[1]。

学术界和工业界的研究人员都在积极推进新的双/多特异性抗体结构，速度远比常规单克隆抗体（mAb）快得多[2]。总体而言，到2025年，双特异性抗体研发管线的增长速度可以达到常规单抗药物的三倍，其中大多数双特异性抗体针对的适应症都是癌症[3]。到2025年，随着全新双特异性抗体进入市场，同时已上市双特异性抗体获批更多适应症，双特异性抗体的全球市场规模预计将超过80亿美元[4]。

双/多特异性抗体的优势

相比传统单抗，双特异性抗体的优势在于更加精准靶向和更强治疗效果，这也充分激发了研发热情[5]。双特异性抗体通过设计，可以与两个不同抗原相结合，或与同一抗原的不同表位相结合。抗体和抗原的结合位点/相互作用位点紧密接近，可以使抗体和抗原形成新的蛋白复合物，并触发新的细胞接触[6]。通常情况下，增强效果比两个单药的联合治疗要更明显。双特异性抗体还可以针对新的治疗靶标或单抗无法实现的靶标组合。

由于双抗或者多抗有着两个或多个位点与靶细胞交互作用，可实现更多靶向结合，并通过重定向具有细胞毒性的免疫效应细胞来激活更多免疫反应，例如T细胞和自然杀伤（Natural Killer）细胞的重定向可以产生更显著的靶向细胞毒性效应[7]。另外，双特异性抗体可同时在单一疾病通路或不同级联信号中充当两种蛋白质的抑制剂。在多结合位点和不同通路的参与之下，还可以降低出现耐药性的几率[8]。

与自体嵌合抗原受体（autologous chimeric antigen receptor）T细胞疗法相比，多特异性抗体设计成T细胞衔接子更具优势，除了无须定制之外，也不会产生异体细胞疗法相关免疫原性反应[9]。

截至2019年中，全球已有20多种双特异性抗体开发和生产的商业化技术平台

形式多样的分子结构

随着蛋白质工程技术的不断进步，双/多特异性结构类型也越发多样：重链和轻链以不同数量和不同形式组合形成各式各样的分子结构。一般来说，双特异性抗体根据是否包含可结晶片段（Fc）进行分类，药代动力学、半衰期、Fc受体介导功能（如适用）和生物学活性等也会因分子结构而有显著差异。

有些双/多特异性抗体在设计时，会改进效应子功能或延长半衰期，与传统单抗类似。有意思的是这类二代产品还是针对老靶点。有些双/多特异性抗体有其他结合位点，靶向专一性更强，可实现新的作用机制[9]。还有一些双/多特异性抗体基于抗体片段或其他蛋白骨架连接。其余的则包括抗体和其他分子偶联，如抗体偶联药物。

我们还可将不同抗原结合位点（如scFv或Fab）与其他蛋白结构域融合产生双特异性抗体，从而进一步功能化[6]。如今，临床试验中大多数候选药物都是BiTE、DART、同二聚体“杵臼结构”("knob-in-hole")抗体或三功能性双特异性抗体[8]。

形式多样的生产工艺

截至2019年中，已有20多种商业化技术平台开发和生产双特异性抗体。Amunix、Invenra、Glycotope、Xencor、诺华、第一三共和罗氏等企业目前都在努力简化双/多特异性抗体开发流程，提高患者安全性，并增强疗效[9]。

双特异性抗体生产平台主要使用哺乳动物细胞。但分子量较小（<50 kD）且结构较简单的双特异性抗体，如Fab片段，不涉及Fc区域或无须糖基化，使用大肠杆菌生产可能是最佳选择。目前，使用酵母（尤其是毕赤酵母）生产双特异性抗体也逐渐引起关注，尤其是对于无须翻译后修饰且分子量稍大的分子。

早期双特异性抗体是通过融合两种杂交瘤细胞系产生四源杂交瘤，但这种工艺会使得重链和轻链随机结合，导致所需组合仅占一小部分。杵臼结构技术，通过在一端引入“杵状结构”并在另一端引入“臼状结构”形成异二聚体，解决了重链错配问题。

如今，大多数双特异性抗体使用交联剂通过化学偶联/共价键合产生，杂交瘤细胞系融合成四源杂交瘤，或者使用基因工程技术生产包含亲本单抗的VH和VL结构域的重组双特异性抗体片段。根据组成和所用技术，它们在抗原结合位点的数量、立体构型、血清半衰期和效应子功能方面会有所不同。

生产面临的诸多挑战

双/多特异性抗体结构类型的复杂性对蛋白表达和制造工艺带来诸多挑战，包括表达量低、产品质量不稳定和蛋白质聚集等。

龙沙已经开发出一套完整的蛋白表达工具，面对越发复杂的蛋白质结构仍然可以做到稳定高效表达。哺乳动物细胞和微生物表达系统不断优化，加上专为双/多特异性抗体量身定制的载体，可实现蛋白表达量高，生产工艺稳定且易于放大。

我们最新版GS基因表达系统GS Xceed®在设计时就已经考虑到了未来的可生产性。该系统可在化学成分明确且不含动物来源成分（chemically defined, animal component–free）的稳健环境中生产出高表达量的产品，且不需要因为稳定性问题而加入甲硫氨酸亚砜亚铵（MSX）。

生产双/多特异性抗体时使用pXC多基因载体，可以让第二类限制性内切酶在单个载体上组装双/多特异性抗体。位点特异性偶联载体也可用于简化抗体偶联的生产。

最近，我们的工具还增加了一项以转座子为基础的技术PiggyBac™，该技术已通过验证。PiggyBac™优先将大基因物质靶向到高表达基因组稳定区域。龙沙还在评估其他合成启动子，可以对分子不同组成（VH和VL）的表达进行调整。通过调节不同组成的表达，提高正确配对链的比例，有助于克服本文以下叙述的纯化和分析问题。

对于某些新的分子类型或组成，微生物系统可能提供更快、更经济的解决方案。龙沙XS™毕赤酵母表达系统可提供快速组合筛选和直接发酵方案，能够在较短的总发酵时间内获得高表达量（高达10 g/L），从而在10-12周内即可完成基因优化和合成，以及两步筛选，并生产出mg级目标产品。

对于所有下游工艺，采用平台解决方案更具挑战性，必须根据双特异性抗体的性质进行工艺优化。由于缺少Fc区域，某些双特异性抗体通常需使用其他树脂（而不是蛋白质A）。因此，通常需要进行树脂筛选，且必须投入更多的时间和精力寻找合适的树脂来纯化这些双特异性抗体。

随着众多双特异性抗体候选药物进入临床，生产工艺放大所面临的挑战越来越引起关注。实验室所使用的众多现有技术均不可放大，技术人员正在努力寻找切实可行的商业化规模生产工艺。

最后，由于双特异性抗体治疗作用较高，因此可能需要替代药物传递方案，如微传递系统。

Lonza龙沙正在努力提升技术，积累实战经验，满足下一代治疗性蛋白质药物的生产需求，包括双特异性抗体。

纯化与分析问题

双/多特异性抗体生产过程中产生的产品相关杂质，其浓度通常比单抗生产过程中的更高，如聚集物和变异体。这些杂质的理化性质与产品本身可能高度相似，如疏水性和净表面电荷。为了去除这些杂质，一般需要增加层析步骤。但鉴于分子之间的相似性，层析步骤的分离度通常低于单抗生产工艺。为达到目标纯度，可能不得不牺牲高产量，而优化这些步骤可能比优化单抗工艺更难。

鉴定产品相关杂质，并明确上清液中有哪些分子，对于开发有效的纯化工艺也至关重要。

由于存在众多重链和轻链，只进行简单的凝胶分析是不够的。因此，质谱分析是必不可少的工具。由于双特异性抗体的治疗作用更高，还要求开发灵敏度更高的分析方法。

分析方法必须专门开发，但是高通量分析能力以及快速分析方法也十分重要。其目标是为分析工作建立平台解决方案，用于不同双/多特异性抗体结构类型。

总结

Lonza龙沙目前正在积极拓展各方面的能力，以满足双特异性抗体等下一代治疗性蛋白质药物的生产需求。在与众多合作伙伴开发临床前项目的过程中，我们发现约三分之二的早期研发管线并不是常规单克隆抗体。我们争取快速规模化生产原液和成品，从而帮助患者尽早获得药品。

此外，开发这些双/多特异性抗体的公司通常规模很小，包括有志于实践商业化策略的虚拟研发公司。有些公司并不打算自建生产车间，而倾向于寻找合适的合作伙伴。这样的合作伙伴不仅可以提供合理的技术解决方案，也能帮助其降低市场准入的风险，并确保随时提供规模化生产能力。

随着越发复杂的蛋白质药物批准上市，双特异性抗体数量不断增加，先进的分子生物学和灵活的生产系统是实现商业化的关键因素。

作 者 简 介

Bernie Sweeney博士，龙沙经验丰富的细胞和分子生物学家，负责开发GS expressionsystems™ 创新技术以及应用。Sweeney博士的团队是龙沙研发体系重要组成，目前致力于改进哺乳动物细胞和微生物系统中越发复杂的治疗性蛋白质药物（如双特异性抗体）的可生产性（manufacturability）。

Lonza龙沙简介

Lonza龙沙是一家起源于瑞士的拥有百年历史的跨国企业。龙沙制药与生物技术业务提供全球化合同定制开发与生产服务(CDMO)，使生物制药公司能为患者带来医学创新。其经营的项目涵盖从前期临床开发到商业化生产的全部过程，涉及哺乳动物和微生物的生物制品、小分子、生物偶联物、细胞和基因疗法等领域。截至目前，龙沙已成功帮助客户从FDA/EMA获得超过25种生物药的商业化生产批准。2020年，龙沙位于广州的生物技术生产基地即将投入运营，提供临床到早期商业化的开发和生产服务，以应对国内不断增长的高质量定制的需求。

了解更多内容，您可以：
关注微信公众号：龙沙生物制药
联系邮箱：guangzhou.biologics@lonza.com
联系电话：021-63403488

参考文献
[1] Labrijn, Aran F. , Maarten L. Janmaat,Janice M. Reichert and Paul W. H. I. Paren. Bispecific antibodies: amechanistic review of the pipeline. NatureReviews Drug Discovery. 18: 585–608 (2019).
[2] Global Bispecific Antibody Market to 2025:Drug Sales & Clinical Pipeline Insights with an $8 Billion MarketOpportunity. Research and Markets. 18 Jan. 2019. Web.
[3] Bispecific Antibodies Market - GlobalIndustry Insights, Trends, Outlook, and Opportunity Analysis, 2018-2026. Rep.Coherent Market Insights. Oct. 2019. Web.
[4] Bispecific Antibodies Market By Type(Immunoglobulin G (IgG) Like Molecule, Non Immunoglobulin G (IgG) LikeMolecule), by Application (Oncology, Autoimmune Disease, Others) - Growth,Future Prospects & Competitive Analysis, 2018 – 2026. Rep. CredenceResearch. Dec. 2018. Web.
[5] Challener, Cynthia A. Witnessing MajorGrowth in Next-Gen Antibodies. BioPharm International. 30: 14–19 (2017).
[6] Kontermann, Roland E. and Ulrich Brinkmann.Bispecific antibodies.Drug Discovery Today. 20: 838–847 (2015).
[7] Carrao, Catarina. The emergence andbenefits of bispecific antibodies. Knect 365.com. 3 Jul. 2019. Web.
[8] Sedykh, Sergey E., Victor V. Prinz,Valentina N. Buneva and Georgy A. Nevinsky. ”Bispecific antibodies: design,therapy, perspectives.” Drug Des. Devel. Ther. 12: 195–208 (2018).
[9] Clift, Ian C. Bispecific, MultispecificAntibodies Grapple with Cancer. Genetic and Engineering News. 7 Feb. 2019. Web.
[10] Scanlan, Claire, Ruta Waghmare, Elina Gousseinov andAlejendro Becerra-Artega. Challenges and Strategies for the DownstreamProcessing of BiSpecific Antibodies (BsAbs).”ADC Review. 6 Jun. 2014. Web.