摘要

延长禁食（PF）的时间，可提升抗应激的能力，但其对延长寿命的作用则知之甚少。我们研究表明，交替地PF和营养丰富的培养基延长了酵母的寿命，并确定这与延长寿命的基因无关。小鼠在一月中采食模拟禁食日粮（FMD）4天，把PF的副作用降到了最小，缩小了多个器官/系统的体积，恢复饲喂后，则提高了祖细胞和干细胞的数量及再生能力。经过两个月的周期性FMD，延长了中年鼠的寿命，减少了内脏脂肪，降低了癌症发病率和皮肤损害，延缓了骨矿物质密度的损失。周期性FMD对老年鼠的作用，促进了海马的神经元再生，降低了类胰岛素一号生长因子（IGF-1）和蛋白激酶A的活性，提升了神经源性分化因子1的水平，认知能力得到提高。于一个先导的临床试验中，经过3个FMD周期，减少了衰老、糖尿病、心血管疾病和癌症的风险因子/生物标志物，却没有重大的副作用，为应用FMDs促进延年益寿提供了支持。

引言

膳食成分和能量水平，是影响衰老和与年龄相关疾病的关键因素(Antosh 等，2011；Blagosklonny 等， 2009；Fontana 等，2010；Gems 和 Partridge,，2013；López-Otín 等，2013；Tatar 等， 2003)。膳食限制（DR）促进代谢和细胞的变化，包括减轻氧化损害和炎症，优化能量代谢和强化细胞保护(Haigis 等Yankner，2010；Johnson 等， 2000；Lee 等 2012b；Longo 和 Finch， 2003；Mair 和 Dillin， 2008；Narasimhan 等， 2009；Smith 等， 2008)。禁食是DR的极端形式，需要戒除所有的食物，但仍可以饮水，这一方法可以作为一种长期的方式应用，如间歇性禁食（IF），或周期性的持续2天或多天的长时间禁食（PF）(Longo 和 Mattson,，2014)。啮齿动物应用IF，促进了糖尿病、心脏病和神经退变的保护性预防(Longo 和 Mattson，2014)。人类应用IF和较不剧烈的养生方案（例如，一周内安排2天，每天只消耗大约500千卡能量），对胰岛素、血糖、C-反应蛋白和血压产生了有益的影响(Harvie 等，2011)。

周期性持续2天或多天的PF，至少要间隔一个星期的正常饮食，正在成为一个保护正常细胞和器官免受毒素和有毒状况危害的高度有效方法(Raffaghello 等 2008；Verweij 等，2011)，同时增加了多种类型癌细胞的死亡(Lee 等， 2012a；Shi 等， 2012)。PF引起了血糖、胰岛素和IGF-1的下降(Lee 等，2010)，和伴有自体吞噬(Cuervo 等，2005；Madeo 等， 2010)。我们研究表明，随着恢复喂食，PF引起的基于干细胞的免疫系统再生，引起了白细胞水平的较多下降（Cheng等，2014）。其他的作者，报告了PF在大鼠中所起的作用，引起了肝和体重的较多减少（Wasselin等，2014）。然而，长时间只供饮水的禁食，对绝大多数人是困难的，它的极端可能引发副作用，包括原先营养不良和机能障碍的进一步恶化，特别是那些年老和体衰的使用者。对这些问题应予重视，必要时进行饮食干预，既诱导得到PF样作用，同时又把这些副作用和完全限食的风险降至最小。

这里，我们确定了一份模拟禁食日粮（FMD），模拟禁食对由PF引起的与抗应激相关标志物的影响，包括血糖和IGF-1的低水平，以及酮体和胰岛素样生长因子结合蛋白-1（IGFBP-1）的高水平（Longo 和Mattson，2014）。我们在小鼠中检验了持续4天FMD，然后仍以标准的自由饮食的周期性方案，可促进健康长寿的假设。此外，我们在一个由38个受试者其中19个分配为FMD组的先导随机临床研究中测试了三轮FMD的影响。

结果和讨论

周期性禁食的啤酒酵母细胞延长了寿命，并诱生了抗应激性

为了确定周期性饥饿是否能使简单生物得益，我们在啤酒酵母细胞（S.cerevisiae）中测试了周期性持续数天禁食（PF）的作用。我们使野型酵母细胞在营养丰富的培养基和水分之间于每48小时切换一次。使酵母细胞在生存期间，至少接受4轮PF。以此来辅助选出适于小鼠并能有效果的禁食持续时间。酵母细胞在二种培养物中周期地切换，延长了它们按时序排列的最长寿命，经过氧化氢处理的存活酵母细胞数量增加超过100倍（图1）。令人惊讶的是，丝氨酸苏氨酸激酶Rim 15或它的下游应激反应转录因子Msn2/4和Gis 1的缺失，对通过遗传和膳食的干预达到好的结果，是重要和必要的（Fabrizio等，2001；Wei 等，2008），也不会妨碍PF对寿命的影响（图1A和1B）。这些结果表明，PF可以保护简单生物免于毒素和衰老机制的损害，这在一定程度上与保守的延寿转录因子无关，则与在线虫（C.analogue）中的结果是一致的，完全禁食不需要应激反应转录因子DAF16，酵母Msn2/4和Gis 1类似物就能发挥作用（Gree 和 Brunet，2009；Kaeberlein等，2006）。

老年小鼠的周期性FMD

能量摄入总量没有降低的周期性FMD促进了内脏脂肪的减少

我们开发了一个能量和蛋白质都非常低的禁食模拟日粮（FMD），它引起了与抗应激性或寿命相关的一些标志物含量的改变（IGF-1，IGFBP-1，酮体和血糖），这与禁食所引起的结果相类似（表S1）。小鼠在16月龄时开始实施每个月有两次FMD，而在FMD之间则给予自由采食。对照饮食方案小鼠在21.5月龄时达到了最大体重（36.6±5.2g）,而FMD组小鼠在每个FMD周期时体重减轻多达～15%，不过，再给予饲喂后，大多数小鼠都恢复了体重（图S1A）。不管怎样，FMD组小鼠在16个月和22个月之间保持着恒定的体重，然后逐渐地减重（图1D）。虽然，FMD小鼠在节食期间受到严重的能量摄入限制，但它们通过一段14天吃得很饱的自由采食所积累的能量，使能量的摄入得到了补偿，相等于那些完全自由采食组小鼠所摄入的能量值（图1E和S1B）。两个组别的小鼠在25月龄后都增加了能量的平均摄入量（图1E）。

FMD结束及恢复饲喂之前，小鼠的血糖水平，比那些对照的正常饲喂组小鼠降低40%。整个研究期中，血糖在恢复饲喂7天内仍返回到正常水平（图S1C）。FMD结束时，酮体增加～９倍，但再饲喂后则恢复到正常水平（图１Ｄ）。ＦＭＤ４天后，血清胰岛素水平降低１０倍，再度饲喂后则恢复到基线水平（图Ｓ１Ｅ）。生长激素／IGF-1轴信号的减少，表示啮齿动物的健康和寿命得到了改善和延长（Brown Borg,2009；Guarente和Kenyon,2000；harrison等，2009；Junnia等，2013；Wullschleger等，2006）。IGF-1在FMD结束时降低了～45%，但即使经过多次FMD周期，均会恢复到原来的水平（图S1F）。抑制IGF-1的IGFBP-1的含量，在FMD程序结束增加了8倍，但其血浓度在再度饲喂1周内，即可恢复到和那些一直自由采食小鼠相同的水平（图S1G）。

为了研究节食诱导身体成分的改变，我们用微型CT评估了沉积体脂重量和去脂体重。28个月时的两个FMD之间的自由采食期中测定，FMD组小鼠表明存在着总脂肪组织减少的趋势（P=0.06）（图1F）。虽然皮下脂肪体积（图1G，1J和1K；灰色区域）不受影响，但内脏脂肪的沉积（图1H，1J，和1K；红色区域）FMD组与对照组相比有了减少（P﹤0.05）。两组的去脂体重保持相同（图1I）。这些表明，周期性FMD对内脏脂肪、血糖和IGF-1水平具有深刻的影响，但IGF-1水平的变化在自由采食时则可以逆转。

器官再生和缩小

FMD（20.5月龄）、FMD-RF（FMD后恢复自由采食后7天）和自由采食（16和20.5月龄）小鼠实施安乐死，测定器官的重量。在FMD停止时，我们观察到肾脏、心脏和肝等器官的重量减少（图1L-1N），肺、脾和脑的重量没有减少（图S1L和S1M），以及体重降低（图S1H-S1J）。这些器官的重量，在再度饲喂后恢复到FMD之前的水平。

双周一次的周期性EMD的长期应用，没有造成25日龄小鼠的收缩期和舒张期左心室容积、射血功能、左心室的重量和心脏功能出现差异（图S1N-S1Q）。FMD停止时，肝萎缩的的标志物血清丙氨酸转氨酶增加，但在再度饲喂后，则恢复到对照组水平（图S1R）。随着再度饲喂，肝细胞重新在肝血管附近聚集（图1 O4，箭头）。FMD对肝再生的作用，由恢复饲喂后24小时时，引起了肝细胞增殖标志物Ki67 10倍量的产生得到证实，但在细胞G 0期该标志物则不存在于细胞中（图1P的S1S）。Ki67的水平在FMD后至少维持3天的升高。肾功能，通过血清肌酐和血尿素氮的测定来评估（图S1T和S1V）（Schnell等，2002）。肾小球和间质纤维化的组织学评估，显示硬化肾小球数量也没有变化（图S1V）。这些资料证实，由于FMD后再饲喂周期的结果，引起了肝脏的再生，即使在FMD4个月以后，肝或肾也没有出现毒副反应。

骨髂肌出生后的生长和再生，需要称为卫星细胞的肌原性前体细胞才能进行（Sinha等，2014）。Pax7的表达，对卫星细胞的发生、存活和自我更新，是至关重要的（Olguin等，2007），而肌源性转录因子MyoD和MyoG促进肌肉的发育和分化（Perry和Rudnick，2000）。在未分化的肌源性细胞中观察到了Pax7上调和降低MyoD的表达（Olguin等，2007）。Pax7(图1Q)和MyoD(MyoG较不明显)年龄相关的下降于20月龄的小鼠中检测到（图S1W和S1X）。FMD停止时，与对照组比较，Pax7的表达降低～40%。也在MyoG中观察到类似的趋势（P=0.074）。恢复饲喂后1周，在20月龄FMD组小鼠中Pax7的表达达到类似于12月龄自由采食小鼠的水平（图1Q）。相比之下，MyoD在老年鼠中的表达没有受到FMD的影响（图S1W和S1X）。总之，这些变化是与再度饲喂时的肌肉再生和复壮相一致的，尽管进一步分析类似进行的造血和神经系统活动，对证实这个假设和确定它的机制原由是必要的。不同时间的异种共生，也表明了老年肝细胞的增殖指数和老年肌肉卫星细胞的增殖和再生能力提升，以及促进成年小鼠中与年龄相关方式的神经再生（Conboy和Rando,2012；Villeda等2011）。有关肌肉和大脑再生的一些蛋白质中的一种生长分化因子-11（GDF-11），可能促成多个系统的再生作用（Katsimpardi等，2014；Sinha等，2014）。这对确定FMD复壮作用，是否部分地可能涉及一些因子包括或与GDF-11有关。

未能诱导自噬，会导致细胞损伤、癌变和衰老（Cuervo等，2005）。自噬可通过间接测定自噬封存（LC3）和降解（P62）来进行监测（Moscat和Diaz Meco，2011）（图S1Y和S1Z）。P62水平，在自噬缺陷细胞中一直是升高的（Komatsu等，2007）。观察到自由采食的20月龄小鼠肌肉中的P62，是伴随着年龄的增加而升高，但FMD组则不是这样的（图1R），这表明FMD可能与再生保护肌肉细胞免于年龄相关性功能下降，包括维持自噬蛋白的正常表达能力有关。

双侧股骨组织中矿物质中密度，28月龄C57BL/6小鼠与12月龄小鼠的相比降低（图1S），这与先前发表的数据是相一致的（Shen等，2011）。28月龄时股骨的骨密度，FMD组较高于对照日粮组（图1S），周期性FMD或减少了年龄相关性骨矿质密度或诱导了骨的再生。

癌症和炎症

C57BL/6小鼠，易于患造血组织的肿瘤和恶性淋巴瘤（Blackwell等，1995）。衰老小鼠的皮下和体内，常有肿瘤或脓肿两者引起的团块（图2A-2H和S2A-S2D）。FMD组与对照组相比，表明肿瘤发病率降低45%（图2I）。到达生命终点，对照组小鼠淋巴瘤的发病率～67%，而FMD组小鼠则只有～40%（图2J），并没有引起肿瘤类型的改变。值得注意的是，FMD还推迟了与肿瘤相关的死亡三个多月，对照组的死亡时间为25.3±0.66个月，而FMD组则为28.8±0.72个月（P=0.003）（图2K）。此外，尸体剖检显示，对照组小鼠有多个（3个或更多）异常病变，高于FMD组小鼠3倍以上（P=0.0067；费歇尔确切概率法）（图2L）。因此，在中年开始周期性FMD，降低了肿瘤发病率，延缓了肿瘤的发生，并使病变数量大幅度地减少，FMD一般地可能影响恶性的肿瘤向良性转变。

炎症，在包括癌症的许多与年龄相关疾病的发生中，有着关键的作用（Bertke等，2013和Morgen等，2007）。病理学分析显示，FMD组小鼠比对照组小鼠减少了炎症组织的数量（例如，炎性反应淋巴结或慢性肝脏炎症，表S2）（图2M）。在C57BL/6小鼠中，观察到的炎性疾病之一，是严重的溃疡性皮炎（图2N）。由于进行性皮肤病损而必须的废弃率，在对照组小鼠为～20%，而FMD组小鼠则只有～10%（Coppé 等，2010)。

FMD对免疫衰老和骨髓衍生的干细胞及祖细胞的影响

年龄相关的由造血作用下降引起的适应性免疫细胞产生减少或变异的现象，称为“免疫衰老”，表现为淋巴样细胞与髓样细胞的比例转换以及贫血和髓系恶性肿瘤的发病率上升（图2O-2S）（Muller-Sieburg等，2004和Shaw等，2010）。全血计数表明，FMD使血象更具活力（图2Q-2S；图S2E-S2R；表S3），与年龄相关的淋巴细胞对髓样细胞的比例（L/M）（图2P）、年龄相关性血小板和血红蛋白的减少得到了逆转（图2Q-2S）。同样，周期性FMD 4个月，导致了红细胞计数和血红蛋白较基线水平有了提高（图2Q-2S）。我们还测定了一组23个细胞因子，FMD组除了IL-12和RANTES（调节活化正常T细胞表达和分泌蛋白）升高，以及GM-CSF（粒细胞巨噬细胞剌激因子）减少以外，均未检测到改变（图S2S-S2U）。这些结果表明，FMD的长期使用，促进了免疫系统的再生和复壮，这与我们先前关于禁食对淋巴细胞数量影响的研究结果，是相一致的（Cheng等，2014）。

其中的骨髓衍生干细胞、造血干细胞和间充质干细胞，是作为一个成年组织和器官再生的潜在资源。为了研究FMD的复壮作用，是否可能与干细胞有关，我们测定了骨髓中造血的（HSPC，lin-Scal-1+C-kit+CD45+）和间充质的（MSPC，lin-Scal-1+CD45-）干细胞及祖细胞的数量。已知HSPCs的数量是随着年龄而增加的，这可能是为了补偿功能的下降（Geiger和Van zant，2002；Morrison等，1996）。年龄相关性增加可能会掩盖禁食或FMD促进干细胞自我更新的作用，这一点我们最近在较年青小鼠研究中已有发现（图S2V）（cheng等，2014）。不同于HSPCs，MSPCs的数量则随着年龄增长而下降（Bellantuono等，2009；Kasper等，2009）。我们证实，成年（8-10月龄）和20.5月龄小鼠中的MSPC的比较数量，随着年龄增长而而减少（图2T），这与以前的报告是一致的（Kasper等，2009；Ratajczak等，2008）。而FMD组小鼠的MSPCs的数量增加到5倍（469.8±179.5FMD对95.5±16.7对照组；图2T和2W），FMD处理组小鼠的BrdU+MSPCs增加到45倍（69.8±34.0FMD对1.5±0.6对照组）（图2T和S2X）。总之，这些数据表明，周期性FMD在促进造血的和间充质的干细胞及祖细胞的增加方面是有效的，这可能会有助于各种类型细胞/系统的再生。